高强度耐力运动影响高脂诱导肥胖模型小鼠白色脂肪棕色化相关蛋白的表达
摘要：文题释义：
解偶联蛋白1(uncoupling protein 1，UCP-1)：位于线粒体中，发挥产热和耗能的功能，在维持动物体温和能量平衡中起重要作用，是棕色脂肪的重要标志基因。
过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅助激活因子α(peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator 1-α，PGC-1α)：主要存在于线粒体含量丰富的组织，是线粒体合成和能量代谢的关键转录共刺激因子。在棕色脂肪适应性产热、白色脂肪棕色化调控过程中发挥重要作用。
Ⅲ型纤维连接蛋白域蛋白5(fibronectin type III domain containing 5，FNDC5)：由Ⅲ型纤维连接蛋白域蛋白5基因编码的一种主要由肌肉和脂肪分泌的膜蛋白，能促进能量消耗，促进白色脂肪细胞向棕色脂肪细胞的转化。
背景：研究表明小鼠体内解偶联蛋白1、过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α(peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α)和Ⅲ型纤维连接蛋白域蛋白5(fibronectin type Ⅲ domain containing protein 5，FNDC5)是影响白色脂肪细胞棕色化的关键蛋白。耐力运动能够有效减轻小鼠体质量，但高强度耐力运动对高脂诱导的肥胖小鼠白色脂肪组织中解偶联蛋白1、PGC-1α和FNDC5蛋白表达的影响尚无确切定论。
目的：研究高强度耐力运动对高脂诱导肥胖小鼠脂肪棕色化相关蛋白解偶联蛋白1、PGC-1α和FNDC5的影响。
方法：4周龄雄性C57BL/6J小鼠，通过8周高脂饲料喂养建立营养性肥胖小鼠模型，对照小鼠一直使用常规饲料喂养。构建成功的肥胖小鼠经过1周适应性跑台运动后进行高强度耐力跑台运动，对照组和肥胖模型组小鼠不运动。8周后分离各组小鼠附睾和腹股沟白色脂肪组织并对比各组脂肪质量变化；取部分脂肪组织进行苏木精-伊红染色，剩余脂肪组织通过Western Blot方法检测脂肪棕色化相关蛋白解偶联蛋白1、PGC-1α和FNDC5的表达情况并对比各组变化。
结果与结论：①高脂诱导能明显增加小鼠体内白色脂肪的质量，并引起脂肪细胞体积明显增大；②高脂诱导能明显减少白色脂肪FNDC5蛋白的表达，解偶联蛋白1和PGC-1α略有减少，但与正常小鼠无明显差异；③高强度耐力运动能有效减少高脂诱导肥胖小鼠体内白色脂肪质量并明显减小脂肪体积；④高强度耐力运动能明显增加高脂肥胖小鼠体内白色脂肪组织中解偶联蛋白1、PGC-1α和FNDC5蛋白的表达，提示高强度耐力运动能够明显促进白色脂肪组织的棕色化过程，从而加速小鼠脂肪产热，达到减去白色脂肪组织的目的。
缩略语：解偶联蛋白1：uncoupling protein 1，UCP-1；过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α：peroxisome proliferators-activated receptor-γ coactivator-1，PGC-1α；Ⅲ型纤维连接蛋白域蛋白5：fibronectin type Ⅲ domain containing protein 5，FNDC5
https://orcid.org/0000-0002-9727-4774 (李玉娇)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程
关键词: 耐力运动, 跑台, 高强度, 肥胖小鼠, 白色脂肪组织, 棕色脂肪组织, 白色脂肪细胞棕色化, UCP-1蛋白, PGC-1α蛋白, FNDC5蛋白
引用本文: 李玉娇, 苏坤霞. 高强度耐力运动影响高脂诱导肥胖模型小鼠白色脂肪棕色化相关蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 707-713.
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高强度耐力运动影响高脂诱导肥胖模型小鼠白色脂肪棕色化相关蛋白的表达
模型小老鼠真实大世界，药康生物硬科技破解新药研发高失败率难题
一直以来，创新药研发都是“九死一生”的过程。
据全球企业增长咨询公司Frost & Sullivan公布的数据显示，全球新药研发过程中，药物发现阶段的研究成功率为51%，临床前阶段的研究成功率为31.8%。但是一旦进入临床阶段，相关研究成功率就陡降至19.3%。这背后，是临床前动物实验的不精准。
每一款新药背后都是数亿元资金的“堆叠”，其中临床阶段研发投入尤为巨大。市场亟需一批“趁手”的动物试验模型，产出对新药临床试验具有足够指导意义的临床前数据。
现下，即将在科创板上市的药康生物(股票代码：688046)正力图以自主原研的小鼠模型，解决这一问题。
公开信息显示，药康生物成立于2017年12月，脱胎于原来的南京大学生物研究院。创始人高翔教授曾任南京大学生物研究院院长，现兼任国家遗传工程小鼠资源库主任、国家实验动物专家委员会委员、国际小鼠表型分析联盟指导委员会委员，拥有20余年实验动物小鼠模型领域研究及管理经验。
成立仅仅4年，药康生物就建立起全球最大的小鼠品系库，数量超过MMRRC、Jackson Lab、EMMA等国际一流小鼠品系资源库，一举扭转这一科研“智能工具”领域进口模型卡脖子的现状。同时，基于多年的技术实践，药康生物也正在打造“真实世界”概念，创制出更加贴近真实世界的小鼠模型，改变现有的临床前试验动物模型生态。
药康生物各业务板块市场地位
还原新药研发试验“真实世界”
“现有小鼠模型的局限性导致了新药开发的高失败率。”华泰证券即在研报中如此分析新药研发的症结。
在华泰证券看来，现有小鼠模型在药物研发方面起到重要作用，但当前药物研发成功率仍然较低。具体而言，现有小鼠模型大多为近交系背景，品系内部个体之间具有高度一致性和遗传稳定性，虽有助于减少干扰变量，但面临缺乏遗传多样性的问题。
另外，现有模型经过长期人工选择，与真实世界中小鼠存在差异。因此临床前有效的药物在临床阶段很有可能因为缺乏针对多样性患者的能力而失败，尤其在针对神经及精神类疾病、心血管疾病、肥胖、糖尿病、NASH等复杂性状疾病时存在“短板”。
如何开发一种既存在多样性，又可以应用于药物研发的小鼠？药康生物认为，问题的答案或在“野生鼠”身上。
一般而言，野生小鼠在自然环境中生存，积累了大量基因突变，遗传多样性远高于实验室近交系小鼠，包括单核苷酸多态性、序列的缺失和重复等，因此成为丰富现有实验动物基因库、更好进行疾病机理研究和新药研发的重要手段。
在这种背景下，药康生物启动了“真实世界小鼠”计划，以基因修饰的野生型小鼠为核心之一，力图塑造出能够还原真实世界情况的小鼠模型，提升研发成功率，继而带来市场需求的跨越式提升。
不过，问题依然存在。野生小鼠具有来源不稳定、存在微生物风险以及繁育难度较大等问题，如何对相关小鼠模型进行标准化，满足新药研发对模型的标准化要求，成为“真实世界小鼠”研发的一大阻碍。
对此，药康生物选择通过构建染色体置换系(CSSs)，以野外捕捉的野生小鼠不断与近交系小鼠交配和筛选，培育出仅有一条染色体与受体近交系不同的新的近交系。公司通过单次Cre/loxp重组实现单条染色体94.1%倒置，长度89.7Mb，系目前有据可查的单次倒置最大长度。
以药康生物最新发布的750胖墩鼠(品系全称：B6-Chr1YP1)为例，该类小鼠常规饮食(非高脂饮食诱导)8周龄后即表现出自发肥胖表型，且胆固醇水平显著升高，瘦素和胰岛素也明显升高，表现出一定程度的瘦素和胰岛素抵抗。与现有的疾病模型(DIO、BKS-db、B6-ob)相比更接近人类肥胖病程的发展，可应用于肥胖、高血脂、脂肪肝等代谢性疾病的研究。
传统的肥胖模型小鼠常采用基因突变或饮食诱导，这些基因突变在人群中实际上非常罕见，饮食诱导也存在变异性大、诱导时间长的问题。“真实世界小鼠”计划中的750胖墩鼠无需饮食诱导，引入自然突变，为解析新的信号通路和疾病机制提供了新资源，也为临床前相关药物评价提供了新的模型选择，为降低临床前与临床药物测试差异带来新的契机。
缔造小鼠模型行业新标准
在此次科创板IPO过程中，药康生物也将打造“真实世界小鼠”计划提升到了新的战略高度。上市募集资金中的一部分即将用于“真实世界动物模型研发及转化平台建设项目”，总投资金额超过2.3亿元人民币。
“动物模型是生命科学研究和新药开发的‘试管’，根据临床及实验需求构建合适的动物模型能够帮助人们高效开展基础研究和各类疾病机理分析。”在药康生物看来，近年来，复杂性状疾病和共生微生物研究已成为热门科研方向，这些研究要求动物模型对真实世界具有更高的仿真模拟能力。
按照计划，药康生物“真实世界动物模型研发及转化平台建设项目”将不单单包括野生型小鼠，也包括无菌小鼠的研发、制备和供应，并将制备和供应多种无菌级基因工程小鼠模型，由特定菌群诱导的菌群人源化小鼠、菌群疾病模型和野生型小鼠疾病模型，建立真实世界动物模型资源库。与此同时，相应的共生微生物研究，及小鼠定制繁育、功能药效分析技术也在包含在公司的大战略当中。
能够快速开启“真实世界小鼠”计划，也源于药康生物多年的积累。
招股书数据显示，截至2021上半年公司已累计形成约20000种具有自主知识产权的商品化小鼠模型，品系资源数量稳居行业前列，具有核心技术与资源禀赋双重壁垒。
其中，在基础科研和药物研发最常见的基因敲除小鼠领域，药康生物就建立了全球最大的基因敲除小鼠品系库，2019年大规模开展小鼠编码基因全敲除计划，旨在预先构建小鼠所有2万余个蛋白编码基因KO和CKO小鼠品系库。
另外，鉴于人和小鼠的靶基因常存在同源度不高的问题，在新药研发过程中也常常需要用到基因人源化小鼠。药康生物也在过去数年中开发了大量、完备的免疫检验点人源化小鼠品系库。
“现有小鼠模型因为遗传背景单一、与真实世界小鼠差距较大等原因，限制了创新药开发的效率，而灵长类动物因为伦理问题，不适用于临床前研究。药康生物的真实世界小鼠模型有望同时解决这两个缺陷，解决现有药物开发低效率的问题，继而在药物研发全产业链占据绝对优势。”华泰证券即预测称，“公司(药康生物)未来有望成为新的行业标准的制定者。”
你实验室里的小白鼠能上市，一只能卖一万元
医学生、生化专业的学生或许想不到，有一天他们在实验室解剖的小白鼠，也能成为拟上市公司的主营业务。
科创板官网显示，江苏集萃药康生物科技股份有限公司（以下简称“集萃药康”或“公司”）已于日前过会，而上一个以包括小白鼠在内的实验动物为主营业务的科创板公司南模生物，已于11月初注册生效。
根据Frost & Sullivan统计，2019年中国实验小鼠产品和服务市场规模为28亿元。相比其他动辄百亿起步的赛道，这么小的一个细分市场，竟然能跑出两家拟上市公司？
一只耗子一万块钱？
根据招股书，2018年至2020年，集萃药康分别录得营收5329.06万元、1.93亿元与2.62亿元，同期扣除非经常损益后归属于母公司的净利润分别为1039.67万元、3372.52万元与6646.04万元。而同时期南模生物营收分别为1.21亿元、1.55亿元与1.96亿元，扣非归母净利润分别为329.04万元、1240.46万元与3275.55万元。
从主营业务构成来看，集萃药康专注于实验小鼠模型，而南模生物涉及的实验动物包括小鼠、大鼠、斑马鱼、线虫等，不过其营收贡献比例较高的基因修饰动物模型主要为小鼠模型。集萃药康主营业务中营收占比过半的是“商品化小鼠模型销售”，包括斑点鼠、免疫缺陷小鼠模型、人源化小鼠模型、疾病小鼠模型与基础品系小鼠，最贵的“斑点鼠”2020年销售单价为11723.99元/只，最便宜的基础品系小鼠也要62.91元/只，而南模生物并未披露小鼠模型的销量与单价。
集萃药康主营业务收入构成 图源：招股书
“斑点鼠”是啥？根据集萃药康招股书，“斑点鼠”其实是基因敲除小鼠，公司于2019年起大规模开展“斑点鼠计划”，旨在预先构建小鼠所有（2万余个）蛋白编码基因的小鼠品系库，目前已经实现了基因敲除小鼠的产品化供应，将原来的客户定制交付周期由4~7个月缩短至最少7天。截至2021年6月30日，公司“斑点鼠计划”资源库已拥有约1.9万个品系，涵盖了肿瘤、代谢、免疫、发育、DNA及蛋白修饰等研究方向的基因。
从公司技术实力来看，集萃药康拥有数量更为庞大的小鼠品系资源，而南模生物的人源化小鼠模型具备一定优势。集萃药康拥有约2万个小鼠模型品系，领先于同行业可比公司，包括南模生物的6017个；而南模生物表示，针对CRO公司、医药公司等开展药效研究及评价的人源化小鼠模型方面，南模生物拥有285种人源化基因修饰模型品系，而集萃药康拥有69个。
同行业可比公司小鼠模型品系数量 图源：招股书
超过70%的毛利率？
从毛利率来看，尽管业务模式和主营产品类似，但集萃药康的毛利率远高于南模生物。2018年至2020年，集萃药康主营业务毛利率分别为68.24%、68.95%与76.21%，同期南模生物仅为44.32%、50.55%与60.34%，而集萃药康的“斑点鼠”业务毛利率更是高达95%。
在对监管问询的回复中，集萃药康表示，公司将繁殖鼠与库存鼠分别计入生产性生物资产和消耗性生物资产，将相关支出计入管理费用，并将消耗性生物减值计入资产减值损失，并未归集至营业成本；而南模生物不存在生产性生物资产与消耗性生物资产，小鼠相关的饲养繁育成本均归集至营业成本核算。并且，比起位于上海的南模生物，集萃药康主要经营场所位于南京和常州，区位人力成本相对较低，2020年公司生产人员平均薪酬为9.39万元，而南模生物为15.88万元。
而监管在问询中也提到，集萃药康研发费用中材料支出较大，如何区分研发领料和生产成本？根据招股书，2018年至2020年，集萃药康研发费用中的材料费用分别为83.55万元、976.22万元与1195.23万元，占研发费用比例为7.95%、32.21%与24.79%；而生产成本中“直接材料”一项同时期分别为777.79万元、1668.86万元与1446.92万元。公司回复称，研发部门直接领料按金额计入研发费用，而研发部门委托生产部门完成部分工作时，按照使用情况按月在生产成本与研发费用之间分摊；公司列出的研发费用材料支出明细则显示，占大头的是实验器材，2018年至2020年实验器材费用分别为44.00万元、728.23万元和941.58万元，占材料支出比例分别为52.66%、74.60%与78.78%，包括DNA提取试剂盒、糖化血红蛋白检测试剂盒等。
集萃药康研发费用中材料支出明细 图源：问询函回复
“确实可能会有企业试图把生产成本转移到研发费用上，一个是毛利率会显得高，再一个科创板有研发费用占营收比例的红线，同时研发费用也有加计扣除的政策。”某投行人士对银柿财经记者表示，“但具体案例还需要具体分析，没有底稿和原始凭证也是比较难判断的。”
2018年至2020年，集萃药康剔除股权激励成本后的研发费用率分别为19.73%、15.72%与16.33%，同期南模生物为14.49%、18.53%与17.54%。